Die Bibliothek von Alexandria, die sicherlich bedeutendste Bibliothek der Antike entstand Anfang des gleichen Jahrhunderts, in der 331 v. Chr. vom Herrscher Alexander dem Großen gegründeten ägyptischen Hafenstadt am Mittelmeer, die nach ihm Alexandria benannt wurde. Es gibt verschiedene antike Quellen über die Bibliothek, unter anderen die früheste Quelle, des im 2. oder 1. Jahrhundert v. Chr. entstandene Aristeasbrief. In diesem wird die Bibliothek erwähnt. Der Aristeasbrief selbst wurde bereits früh aufgrund philologischer Textkritik als Fälschung erkannt. Des Weiteren existieren Beschreibungen der Bibliothek in Werken griechischer und römischer Autoren des 1. und 2. Jahrhunderts n. Chr., wie etwa Strabon, Seneca, Plutarch und Sueton. Weitere Informationen finden sich in zwei Schriften des griechischen Arztes und Anatoms Galenus. Doch berichten die Quellen teilweise Widersprüchliches. Die ausführlichste antike Beschreibung der Stadt Alexandria ist bei Strabon erhalten, der sie um 26–20 v. Chr. besuchte. Er erwähnt in seinem Bericht das Museion (eine den Musen gewidmete Lehranstalt), das im Osten der Stadt am Meer lag. In der Nähe stand ein Theater und ein Tempelkomplex, der dem Poseidon geweiht war. Bei neueren Untersuchungen sind im Hafengebiet im Nordosten der Stadt monumentale Baustrukturen gefunden worden. Es handelt sich vielleicht um die Fundamente des bei Strabon erwähnten Poseidon-Tempels. Laut Strabon lagen die Räumlichkeiten der Bibliothek im Palastbezirk der Stadt. Dieser nahm fast ein Drittel der gesamten Stadt ein.
Er lag im Nordosten der Stadt. Im Meer, das dem Bezirk vorgelagert war, befand sich die Antirhodos (Nr. 2 auf dem Stadtplan oben) genannte Insel mit weiteren Palastanlagen. Die Bibliothek verfügte über einen riesigen Bestand an literarischen Schriften sowie wissenschaftlicher Literatur aus den verschiedensten Fachgebieten. Unterschiedliche Quellen berichten von 400.000 bis 500.000 Papyrusrollen, einige sogar von 700.000 Exemplaren. Sie umfasste Werke über naturwissenschaftliche Themen (besonders Astronomie), Mathematik, Medizin und Philosophie. Bis heute ist jedoch kein Papyrusfragment entdeckt worden, das der Bibliothek von Alexandria eindeutig zuzuordnen ist. Und archäologische Überreste wurden ebenso wenig gefunden. Das Schicksal der Bibliothek von Alexandria ist bis heute ungeklärt, angeblich fiel sie einem Feuer bei Cäsars Eroberung der Stadt im Jahr 48 v. Chr. zum Opfer. Doch diese Version ist umstritten und auch unwahrscheinlich. Dagegen spricht vor allem die große Entfernung – möglicherweise etwa ein halber Kilometer – zwischen dem Hafen, wo das Feuer aus militärisch-taktischen Gründen gelegt wurde, und der Bibliothek. Hätte sich das Feuer tatsächlich bis dahin verbreitet, wäre auch ein großer Teil der Stadt mit bedeutenden Monumenten dem Feuer zum Opfer gefallen, wovon aber nichts berichtet wird.
Eine kleinere Tochterbibliothek befand sich im
Serapeion von Alexandria, einem Tempel der ägyptisch-hellenistischen Gottheit Serapis. Das Aussehen des Serapeion im 4. Jahrhundert, beschreibt der römische Historiker
Ammianus Marcellinus (330–395) in seinem Werk Res gestae XXII, 16: Außerdem gibt es in Alexandrien sehr hohe Tempel, unter denen sich vorzüglich das Serapeion auszeichnet, von dem ich, soviel es auch durch eine magere Beschreibung verliert, wenigstens so viel bemerke, dass es durch weite mit Säulengängen umstellte Vorhöfe, durch Bildsäulen, zum Sprechen getroffen, und andere Kunstwerke in Menge so prächtig verziert ist, dass nach dem Kapitol, in dem das ehrwürdige Rom der Ewigkeit trotzt, in
der weiten Welt nichts Prächtigeres zu sehen ist. Die Bibliothek im Serapeion besaß 42.800 Schriftrollen, wahrscheinlich zum Teil ausgesonderte Dubletten der Mutterbibliothek.
Tempel und Bibliothek wurden im Jahr 391 durch den damaligen Patriarchen von Alexandria, Theophilos im Rahmen gewaltsamer Auseinandersetzungen zwischen dem christlichen Kaisertum (vertreten durch Kaiser Theodosius I., sowie den staatlichen und kirchlichen Behörden Alexandrias) und dem paganen Teil der Bevölkerung, vollständig zerstört.